Long Lis grupp vid School of Life Sciences, Peking University publicerade en artikel med titeln "Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the TOM-TIM23 supercomplex", publicerad i Nature Structural & Molecular Biology. Studien rapporterar strukturella och biokemiska resultat av TOM-TIM23-superkomplexet som förmedlar proteintransport i mitokondrier, avslöjar en ny väg för proteinimport genom TOM-komplexet över mitokondriernas yttre membran och omdefinierar kärnsammansättningen av TIM23-transportörkomplexet i det inre mitokondriella membran.
Som en av de viktigaste organellerna i eukaryota celler spelar mitokondrier viktiga roller i energiförsörjning, intracellulär metabolism, homeostas och apoptos. Mitokondrier har en unik inre och yttre dubbelskiktslipidmembranstruktur, med mer än 1,000 proteiner fördelade inuti. 99% av mitokondriella proteiner kodas av cytosoliska gener, syntetiseras i ribosomer i cytoplasman och transporteras över membranet till mitokondrierna för att utföra sina funktioner. Därför är transporten av mitokondriella proteiner avgörande för att upprätthålla och reglera mitokondriell aktivitet, och mutationer i relaterade gener är nära förknippade med utvecklingen av många metabola sjukdomar och cancer hos människor. Li Longs grupp har arbetat med att utforska de molekylära mekanismerna genom vilka mitokondriella proteiner kommer in i mitokondrier, och publicerade arbeten inkluderar att lösa vägen genom vilken mitokondriella membranproteiner kommer in i det inre membranet via TIM22-transportkomplexet (Zhang Y. et al Cell Research 2021). Rollen för TOM-TIM23-superkomplexet i mitokondriell proteintransport är ännu viktigare i denna studie. Detta superkomplex, sammansatt av dussintals proteinsubenheter, spänner över de inre och yttre mitokondriella dubbelskiktsmembranen och kontrollerar transporten av mer än 500 mitokondriella lösliga och membranproteiner. Under de senaste 40 åren har forskare utförligt och intensivt studerat de individuella subenheterna i transportkomplexen TOM och TIM23. Men på grund av den mycket dynamiska naturen hos detta superkomplex är förståelsen av den centrala frågan om hur dessa subenheter sätts samman för att bilda proteintransportvägen fortfarande mycket begränsad, särskilt för TIM23-komplexet i det endosomala membranet, där kärnans sammansättning transportenheten har varit mycket otydlig.
I den här studien började författarna först med monteringen av ett stabilt TOM-TIM23-superkomplex, utforskade olika monteringsscheman och valde slutligen att sammansmälta grönt fluorescerande protein med mitokondrieprotein som transportsubstrat, och fångade det mellanliggande tillståndet för TOM-TIM23. superkomplex för transport av proteinsubstrat i jästceller. Efter in vitro-rening kunde detta mellanliggande tillstånd fortfarande stabiliseras för ytterligare strukturella biologi- och biokemistudier. Genom singelpartikelanalys av detta mellantillstånd med kryo-elektronmikroskopi fann författarna att det finns en direkt interaktion mellan TOM-komplexet beläget i det yttre membranet och TIM23-komplexet beläget i det inre membranet, vilket förbinder de inre och yttre mitokondriella membranen. , som effektivt levererar proteinsubstratet från det yttre mitokondriella membranet till det inre membranet (Fig. 1a). I synnerhet löstes TOM-komplexet till en upplösning på 4,1 Å. Strukturen avslöjade en "polär aminosyraväg" inom den inre väggen av Tom40-kanalsubenheten, som är konserverad över arter och förmedlar passagen av proteinsubstratet genom Tom40-mellanporen i oveckad form (Fig. 1b). Denna väg skiljer sig från de två transmembrana vägarna i Tom40 som tidigare föreslagits baserat på biokemiska experiment, vilket visar mångsidigheten hos TOM-komplexet för att effektivt känna igen och transportera olika mitokondriella proteiner.
Fig. 1. Struktur för TOM-TIM23 superkomplexet. (a) Schematisk sammansättning och kryo-elektronmikroskopistruktur av TOM-TIM23 superkomplexet. (b) Kryo-elektronmikroskopi strukturell modell av TOM-komplexet som innehåller proteinsubstratet. (c) AlphaFold2-strukturmodell av Tim17-Tim23-Mgr2-heterotrimeren
Dessutom introducerade författarna systematiskt onaturliga aminosyror på olika ställen av proteinsubstratet och undersökte omgivningen av proteinsubstratet i transportvägen för TOM-TIM23 genom att använda fototvärbindning, vilket identifierade kärnsubenheten som direkt hjälper substratet att korsa två lipidmembran. De experimentella resultaten visade att det C-terminala fragmentet av proteinsubstratet kan tvärbinda med Tom40-subenheten i det yttre membranet, ett resultat som överensstämmer med strukturella observationer. Överraskande nog tvärbinder det N-terminala fragmentet av proteinsubstratet med både Tim17- och Mgr2-subenheter i det inre membranet, men inte med Tim23-subenheten, som vanligtvis identifieras som utgörande den inre membrantransportkanalen. Detta resultat tyder på att det kan finnas en betydande snedvridning i uppfattningen av kärntransportvägen för TIM23-komplexet i tidigare studier. För att ytterligare identifiera kärntransportörsubenheterna och vägarna i TIM23 använde författarna en kombination av AlphaFold2-modellering, biokemisk tvärbindning, jästgenetik och in vitro-transport av mitokondriella proteiner, och fann att kärnkomponenten i TIM23-komplexet är en heterotrimer bestående av Tim23, Tim17 och Mgr2 subenheter, med Tim17 och Mgr2 ansikte mot ansikte bildar en kanalliknande struktur, medan Tim23 binder till Tim17 i en rygg mot rygg form och inte är involverad i kanalbildning (Fig. 1c) ). Under proteintranslokation passerar proteinsubstratet genom den kanalliknande strukturen som bildas av Tim17 och Mgr2 och kommer inte direkt i kontakt med Tim23-subenheten. Mutagenesexperiment visade att nedbrytning av Mgr2 i jäst inte påverkade proteintranslokation, vilket tyder på att endast Tim17 krävs i den kanalliknande struktur som bildas av Tim17 och Mgr2. Anledningen till att Tim17 kan hjälpa proteiner att passera det endosomala membranet beror på dess unika ytaminosyrafördelning: å ena sidan har Tim17 en starkt konserverad negativt laddad region vid ingången till det endosomala membranet som kan störa den lokaliserade Å ena sidan har Tim17 en mycket konserverad negativt laddad region vid ingången till det inre membranet , vilket kan störa den lokala fosfolipidbilagerstrukturen och sänka energibarriären för proteiner att passera lipidmembranet; å andra sidan har Tim17 en konserverad hydrofob region i mitten av vägen, vilket hjälper till att hålla mitokondriens inre membran i ett lufttätt tillstånd och för att upprätthålla den membranpotential som är nödvändig för mitokondriella fysiologiska aktiviteter. Genom att ta samman resultaten av olika strukturella och biokemiska experiment kan man dra slutsatsen att TIM23-komplexet, med Tim17-subenheten i sin kärna, antar ett blandat läge för att hjälpa proteintranslokation, dvs. Tim17 kan antingen dynamiskt binda till andra subenheter för att bilda en kanal för att hjälpa proteiner över membranet, eller så fungerar Tim17 i arbetsläget för insättningsenzym för att åstadkomma proteintranslokation ensam utan behov av kanalbildning. Detta resultat korrigerar missuppfattningen i fält under de senaste 40 åren att Tim23-subenheten utgör en kärnkanal.
Sammanfattningsvis utvecklade denna studie en ny strategi för proteintransportstudier, avslöjade den kritiska vägen för mitokondriella proteiner att korsa dubbelskiktslipidmembranet via TOM-TIM23-superkomplexet (Figur 2), omkullkastade den långvariga fältkunskapen om kärnkomponenterna i det inre membranet TIM23-transportkomplexet, och upptäckte ett helt nytt sätt för proteintransportenzymdrift, som lägger en solid grund för en omfattande och djupgående förståelse av mitokondriell biosyntes. syntes, vilket lägger en solid grund för en omfattande och djupgående förståelse av mitokondriell biosyntes.
Figur 2. mitokondriell TOM-TIM23 transportväg
Long Li är motsvarande författare till uppsatsen, och Xueyin Zhou, en doktorand från Peking University-Tsinghua Joint Center for Life Sciences klass 2018, Yuqi Yang, en doktorand från School of Life Sciences klass 2019, Dr. Peng Wang från Peking Universitys kryoelektronmikroskopiplattform och Shanshan Wang, en doktorand från School of Life Sciences-klassen 2020, är de första författarna. Dongjie Sun, en före detta tekniker i Li Longs labb, Xiaomin Ou, en doktorand vid College of Life Sciences, klass 2022, och Yuke Lian, en doktorand vid College of Life Sciences, klass 2021, gjorde betydande bidrag till denna forskning. Prof. Ning Gao och biträdande forskare Ningning Li från School of Life Sciences, Peking University, och forskare Xinzheng Zhang från Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, gav stor hjälp vid beräkning av kryoelektronmikroskopidata, och Prof. Qing Li och Prof. Gain Chang från School of Life Sciences, Peking University, gav viktig vägledning om jästgenetik respektive fototvärbindningsexperiment. Forskningsarbetet stöddes av Peking Universitys kryoelektronmikroskopiplattform, High Performance Computing Center, Instrumentation Center of School of Life Sciences och National Phoenix Protein Platform, och finansierades av State Key Laboratory of Membrane Biology, Peking University-Tsinghua Joint Center för Life Sciences och National Natural Science Foundation of China.